ROSA CIFUENTES RIQUELME¹, José Padilla Ruiz¹, Belén de la Morena Barrio¹, Eugenia de la Morena Barrio¹, Carlos BRAVO PEREZ¹, Pedro Garrido Rodríguez², ANTONIA MIÑANO NAVARRO¹, Vicente Vicente García¹, Javier CORRAL DE LA CALLE¹

(1) HEMATOLOGÍA Y ONCOLOGÍA MÉDICA CLÍNICO-EXPERIMENTAL, IMIB-Arrixaca, España
(2) Servicio de Hematología y Oncología Médica, Hospital Universitario Morales Meseguer, Centro Regional de Hemodonación, Universidad de Murcia, IMIB-Arrixaca, CIBERER, Murcia, Spain., 30003, España (Región de Murcia)

Introducción. Las variaciones estructurales (VEs), alteraciones genéticas >50pb con gran impacto patológico, se estudian en muchos desórdenes mediante MLPA, una técnica de PCR múltiple que emplea dos oligonucleótidos que reconocen sitios adyacentes. En deficiencia de antitrombina (AT), el 3-5% de casos se deben a VEs que afectan a SERPINC1. Sin embargo, la alta concentración de secuencias Alu intragénicas (elementos repetitivos implicados en la formación de VEs), y la identificación por nuestro grupo de VEs de novo en este gen, sugieren que estas VEs pueden estar subestimadas. Objetivo. Estudio de VEs en SERPINC1 en pacientes con deficiencia de AT mediante MLPA.

Estudiamos una cohorte de 403 casos no relacionados con deficiencia de AT caracterizados a nivel funcional y molecular. Las VEs se analizaron mediante MLPA (Probemix P227, MRC Holland), y su resolución nucleotídica se consiguió mediante secuenciación de nanoporos y/o PCRs largas (Long Amp Taq NEB) y NGS.

El algoritmo de diagnóstico molecular que seguimos (Fig1) identificó mediante secuenciación 243 SNVs o pequeñas indel. MLPA identificó 16 VEs: 9 deleciones completas, 5 deleciones parciales y 2 duplicaciones parciales. La caracterización nucleotídica de estas VEs evidenció 2 casos en los que el diagnóstico del MLPA no fue preciso: en 1 caso la deleción de un exón marcada por MLPA no era completa, mientras que en otro, una deleción parcial de un exón no se detectó mediante MLPA . Además, 4 VEs que afectan a intrones (tres inserciones de un retrotransposón y una deleción de un intrón) no se detectaron por MLPA. Dado que el algoritmo diagnóstico molecular finaliza cuando se detecta una variante potencialmente patogénica tras la secuenciación de exones, planteamos que pudieran existir VEs parciales ligadas a mutaciones exónicas que no se llegan a estudiar. Para resolver esta cuestión, analizamos mediante MLPA 40 casos con deficiencia tipo I que presentaban una mutación (SNV o indel) potencialmente causal detectada por secuenciación en un exón del gen. El MLPA identificó en uno de estos casos una deleción del exón 7. Sin embargo, el paciente presentaba una deleción de 29pb que afectaba parcialmente a una sonda del MLPA (Fig2A). Con la finalidad de identificar otras situaciones en las que el MLPA pudiera generar resultados incorrectos, analizamos 28 casos con alteraciones genéticas afectando las sondas empleadas en el MLPA de diferentes exones: 23 SNVs, 3 pequeñas deleciones, 1 pequeña inserción y 1 variante compleja pequeña. En dos casos, el MLPA identificó erróneamente VEs: una variación compleja, que implica la duplicación de 28pb y deleción de 4bp, y un SNV que afecta el último nucleótido de una sonda, en la zona de interacción de las sondas. En ambos casos el resultado del MLPA sugería la deleción completa del exón (Fig2B y C).

Pequeñas inserciones o deleciones, o incluso mutaciones puntuales, que afectan a la hibridación de las sondas del MLPA pueden llevar a un diagnóstico incorrecto de deleción completa del exón. Otra limitación del MLPA es que tampoco detecta VE intrónicas. No obstante este método sí que ha podido identificar 15 VSs en SERPINC1 responsables de la deficiencia de AT y ha permitido descartar la existencia de VEs en casos con SNV/indels patogénicas en nuestra cohorte de pacientes con deficiencia de AT.