LA PSEUDOGENIZACIÓN DE OVASTACINA EN CONEJO ES RESPONSABLE DE LA FALTA DE BLOQUEO DE LA POLISPERMIA A NIVEL DE ZONA PELÚCIDA.

Autores:

Miriam Balastegui Alarcón1, Paula Cots Rodríguez1, Leopoldo Gonzalez Brusi1, Marta García Villar2, Pilar Soria Monzó1, JOSE BALLESTA GERMAN1, MARIA JOSE IZQUIERDO RICO1, MANUEL AVILES SANCHEZ1

Afiliaciones:

(1) INTEGRACIÓN MORFOFUNCIONAL DE CÉLULAS Y TEJIDOS, IMIB-Arrixaca, España
(2) Departamento de Biología Celular e Histología, Facultad de Medicina, Universidad de Murcia-IMIB- Arrixaca, Murcia, España., 30007, España (Región de Murcia)

Comunicación:

Antecedentes:

Durante la fecundación se produce la interacción entre el espermatozoide y el óvulo. Para que este proceso se produzca eficientemente se han desarrollado mecanismos que evitan la entrada de más de un espermatozoide (polispermia) que da lugar a la muerte embrionaria. Dependiendo de la especie de mamífero, el bloqueo de la polispermia se puede producir a nivel del oolema, la zona pelúcida (ZP) o ambos. En cuanto al bloqueo de la polispermia a nivel de ZP, las proteínas ovastacina (ASTL) y ZP2 juegan un papel crucial. El espermatozoide se une específicamente a la proteína ZP2 de la ZP y tras producirse la fusión entre ambos gametos se produce la liberación por exocitosis de los gránulos corticales ovocitarios. Estos gránulos corticales contienen una proteasa llamada ovastacina (ASTL). Ovastacina produce una proteolísis en el dominio N-terminal de ZP2, zona de unión del espermatozoide a la ZP, de modo que impide la unión de los espermatozoides y es responsable del bloqueo de la polispermia (Burkart et al., 2012). En la coneja, se ha observado que el bloqueo de la polispermia no se produce a nivel de la ZP; sin embargo, no se conoce los mecanismos moleculares responsables de este proceso. El objetivo del presente estudio es averiguar la presencia de ovastacina en la coneja y su relación con el bloqueo de la polispermia.

Métodos:

Todos los procedimientos realizados fueron aprobados por el Comité Ético de Experimentación Animal de la Universidad de Murcia. Se aisló ADN genómico (ADNg) de muestras auriculares de conejo europeo (Oryctolagus cuniculus), utilizando el Kit Puregene Bucal Cell Core KitA (Qiagen Se obtuvo el ARN total de muestras ováricas de conejo, utilizando el kit RNAqueous (Thermo Fisher Scientific) a partir del cual se sintetizó en ADNc el kit de transcripción inversa SuperScript III. Tomando como molde el ADNg y el ADNc obtenido, el gen ASTL se amplificó parcialmente mediante PCR utilizando cebadores específicos. Estos cebadores fueron diseñados a partir de la zona de homología entre la secuencia de ASTL de humano y ratón. Esta secuencia se encuentra dentro del exón 6 del cromosoma 2 de conejo y coincide con la ubicación del centro activo de ASTL en estas especies. Los amplicones obtenidos se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,5% y fueron visualizados bajo luz ultravioleta. Posteriormente se purificaron utilizando el kit DNA Clean and Concentrator-5 (Zymo Research y fueron secuenciados automáticamente usando 3500 GeneticAnalyzer (Applied Biosystems).

Resultados:

Se obtuvo un amplicón de 161 pb del gen ASTL tanto en ADNg como ADNc. Este corresponde a una región dentro del exón 6 que corresponde con la región codificante del centro activo de la proteína.. El análisis de homología reveló una alta identidad cuando se comparó con la misma región del gen humano y ratón respectivamente. Además se identificó un cambio de un nucleótido (una guanina por una adenina) el cual provoca la aparición prematura de un codón de STOP.

Conclusiones:

Tras la secuenciación y comparación de su homología con las secuencias de humano y ratón, se evidencia que la mutación que conlleva la generación de un codón STOP afecta al centro activo de la proteína ubicado en el exón 6 del cromosoma 2 en conejo. Por consiguiente, el bloqueo de la polispermia a nivel de ZP en conejo quedaría imposibilitado debido a la pseudogenización de la proteasa ASTL, lo que explica la pérdida de bloqueo de la polispermia a dicho nivel y siendo efectivo solamente a nivel de oolema.


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