LA DEFICIENCIA DE MIR-146A EN NEUTRÓFILOS PROVOCA UNA REPROGRAMACIÓN METABÓLICA CON CONSECUENCIAS EN INMUNOTROMBOSIS.

Autores:

Laura Zapata Martínez1, SONIA ÁGUILA MARTÍNEZ2, Juan Carlos García Cañaveras3, MARIA PIEDAD FERNÁNDEZ PÉREZ2, NURIA GARCÍA BARBERÁ2, ASCENSION MARIA DE LOS REYES-GARCIA PASTOR2, laura reguilón gallego2, Vicente Vicente García2, Agustín Lahoz3, Rocío González-Conejero Hilla2, CONSTANTINO MARTÍNEZ GÓMEZ2

Afiliaciones:

(1) Centro Regional de Hemodonación- Servicio Murciano de Salud. C/ Paseo de Garay, 2, 30003, España (Región de Murcia)
(2) HEMATOLOGÍA Y ONCOLOGÍA MÉDICA CLÍNICO-EXPERIMENTAL, IMIB-Arrixaca, España
(3) Unidad de Biomarcadores y Medicina de Precisión (UBYMP). IIS La Fe (Valencia), España (Comunidad Valenciana)

Comunicación:

Antecedentes:

Los neutrófilos juegan un papel primordial como primera línea de defensa en la infección por patógenos a través de mecanismos como la fagocitosis y la formación de trampas extracelulares de neutrófilos (NET). Nuestro grupo ha demostrado en un modelo murino que la deficiencia de miR-146a, un regulador negativo de inflamación que regula la inmunotrombosis en patologías inflamatorias como la sepsis o la fibrilación auricular, promueve la formación de NET, aunque el mecanismo molecular subyacente es desconocido. La NETosis necesita de un elevado consumo energético y metabólico pero se desconoce si la deficiencia de miR-146a estaría implicada en alteraciones del metabolismo celular que favorezcan la formación de NET. Por tanto, decidimos investigar si la deficiencia en miR-146a condiciona cambios metabólicos en neutrófilos murinos.

Métodos:

Los neutrófilos se purificaron a partir de médula ósea de ratones WT y miR-146a-/-. Se analizaron la explosión respiratoria (tasa consumo de oxígeno: OCR) y la glicólisis global (tasa de acidificación extracelular, ECAR) por Seahorse XFe96 Analyzer (Agilent). La producción de ROS celulares y ROS mitocondriales se midieron por citometría de flujo. La expresión de NADPH oxidasa (Nox2) y otras enzimas metabólicas se analizaron por RT-qPCR.La fosforilación de ERK se analizó por western blot. El estudio metabolómico profundo no dirigido se realizó por espectrometría de masas de alta resolución (quadrupole-orbitrap mass spectrometer, Q Exactive) junto con cromatografía de ultra alta resolución (Vanquish). Por último, se hizo un modelo de trombosis arterial con FeCl3 analizando el contenido de histona 3 citrulinada (Abcam) en el trombo mediante microscopía de fluorescencia.

Resultados:

Los neutrófilos miR-146a-/- mostraron una mayor OCR, en comparación con neutrófilos WT. Además, estos neutrófilos mostraron una mayor generación de ROS que procedía de la NADPH oxidasa sin detectarse diferencias en la expresión de Nox2. Mediante el uso del Seahorse se observó que neutrófilos de ratones miR-146a-/- presentaron una mayor glicólisis (ECAR) que neutrófilos WT.El estudio metabolómico mostró un mayor incremento del piruvato y del lactato (productos de la glicólisis) en neutrófilos miR-146a-/- vs WT. Además los niveles de los intermediarios de la ruta de las pentosas fosfato (PPP), como el NADPH, fueron más altos en neutrófilos miR-146a-/- vs WT. Por lo tanto, la alta producción de ROS por parte de la NADPH oxidasa fue sustentada por la elevada generación de NADPH en la PPP.Como la producción de ROS provoca la fosforilación de ERK, quisimos valorar sus niveles en neutrófilos.Como cabía esperar, observamos mayores niveles de p-ERK en neutrófilos 146a-/- vs WT tanto en condiciones basales como con PMA. Sin embargo, no se observaron diferencias en la expresión en una de las principales enzima de esta ruta, la glucosa 6-P deshidrogenasa. Finalmente, en el modelo de trombosis arterial in vivo se observó mayor cantidad de citH3 (marcador de NET) en los trombos de ratones miR-146a-/- vs WT.

Conclusiones:

La ausencia de miR-146a en neutrófilos provoca la reprogramación metabólica de éstos. Este proceso aumenta el flujo glucolítico y la activación de la PPP promoviendo así una mayor generación de ROS y fosforilación de ERK, procesos relevantes en NETosis. Por tanto, estos cambios metabólicos fundamentales en el neutrófilo podrían ser clave en la inmunotrombosis mediada por miR-146a en diversas patologías, tal como apoyan nuestros resultados de trombosis in vivo.


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